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ECL OIE

Infos techniques

Tests de référence utilisés dans notre laboratoire :

Identification par réaction en chaîne par polymérase (PCR)


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Annexes


1- Objectif

Les E. coli pathogènes chez les animaux et zoonotiques (APZEC) sont porteurs de gènes codant pour des facteurs de virulence pouvant causer des maladies chez les animaux ou les humains. Les APZEC sont divisés selon différents pathotypes : ETEC, EPEC, STEC/VTEC et ExPEC. Les ETEC sont porteurs d’un ou plusieurs gènes codant pour les entérotoxines LT, STa et STb. Chez le porc, les ETEC affichent principalement les gènes codant pour le fimbriae F4 ou F18. Pour leur part, les EPEC possèdent le gène eae codant pour Eae ou Intimine. Les STEC/VTEC sont quant à eux porteurs des gènes codant pour VT1/Stx1 et/ou VT2/Stx2 et les STEC/VTEC potentiellement pathogènes pour l’homme et portent fréquemment le gène eae. La plupart des ExPEC détiennent les gènes codant pour aérobactine, et en général, ont les gènes codant pour Tsh, CNF ou le fimbriae P.

L’objectif de cette procédure est de détecter par PCR multiplex la présence de gènes dans des cultures d’E. coli afin de déterminer leur pathotype (ETEC, EPEC, STEC ou ExPEC). De plus, la confirmation de la présence de gènes codant F4 ou F18 chez les ETEC permettra une identification comme agent causant la diarrhée chez le porc. Cette procédure peut être appliquée pour l’identification des APZEC à partir de culture d’enrichissement en bouillon LB provenant d’échantillons cliniques ou de colonies isolées sur milieu solide MacConkey ou autre.

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2- Principe

La méthode est fondée sur l’amplification par PCR de gènes d’ADN spécifiques par des oligonucléotides déclenchant le début de la réaction PCR. La réaction PCR est réalisée en utilisant des amorces spécifiques (Annexe 1).

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3- Méthodologie

3.1- Préparation de l’échantillon

Les cultures ensemencées sur milieu solide (ex. TSA, gélose sang ou gélose MacConkey) sont traitées selon les étapes suivantes :

  • Prendre une strie dans le premier quadrant avec une anse ou un coton-tige et ensemencer dans un tube de 5 ml de bouillon LB.
  • Les écouvillons provenant de fèces ou de tissus sont ensemencés directement dans un tube de 5 ml de bouillon LB.
  • Incuber toute la nuit à 37±1oC.

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3.2- Préparation de l’ADN

(Méthode adaptée de la méthode utilisée par le Laboratoire de lutte contre les zoonoses d’origine alimentaire MFLP-86)

  • Identifier l’échantillon par un code sur le dessus d’un tube de 1,5 ml, centrifuger 1 ml de la culture LB incubée toute la nuit à 37±1oC,à 12 000 RPM pour 2 minutes.
  • Jeter le surnageant dans une bouteille en verre Corning réservée à cet usage.
  • Ajouter 1 ml PBS ou FA buffer (Difco) au culot, bien mélanger (vortexer ou mélanger avec une pipette avec des mouvements allant de haut en bas).
  • Centrifuger à 12 000 RPM pour 2 minutes, enlever le surnageant et resuspendre le culot dans 0,5 ml d’eau stérile Milli-Q (vortexer ou mélanger avec une pipette avec des mouvements allant de haut en bas).
  • Chauffer à 100oC pendant 10 minutes, centrifuger à 12 000 RPM pour 2 minutes. Transférer le surnageant dans un autre tube, et identifier le tube. Si un grand nombre de tubes est préparé, s’assurer que les tubes contenant de l’ADN, soient gardés sur glace ou au froid.
  • Conserver l’échantillon ADN à -20oC, jusqu’à son utilisation.

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3.3- Mise au point de la réaction en PCR

Pour chaque échantillon, prévoir un mélange de réaction de 25 μl PCR (Annexe 2). Le volume des réactifs peut varier en fonction du volume final de la réaction. L’eau stérile Milli-Q est employée pour les réactions PCR. Pour chaque essai en PCR, un contrôle positif et deux contrôles négatifs doivent être inclus. Le contrôle positif est composé d’ADN obtenu à partir de souches d’E. coli possédant les gènes de virulence testés. Le premier contrôle négatif est fait à partir d’ADN d’une souche d’E. coli non-pathogène. L’autre contrôle négatif est quant à lui constitué en ajoutant de l’eau stérile Milli-Q. Les mélanges de réaction PCR sont incubés dans un thermocycleur programmé selon le profil thermique décrit (Annexe 2).

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3.4- Électrophorèse sur gel d’agarose

Préparer un gel d’agarose de 1,8 % (w/v) avec une solution 1X Tris/EDTA (Annexe 3). À chaque puits du gel nous ajoutons 15 μl du produit de la réaction PCR auquel nous avons ajouté un colorant à une concentration finale 1X. Faire migrer les échantillons dans un tampon 1X (Tris/EDTA) à un voltage constant (96V). Employer un standard de poids moléculaire approprié pour les différents poids correspondants aux différents amplicons. (Annexe 1). Prendre en considération que l’évaluation de la présence des gènes de virulence se fait selon une bande correspondant au poids moléculaire.

Le bromure d’éthidium doit être ajouté au gel d’agarose pour permettre la visualisation de l’ADN. Ce réactif est un agent intercalant de l’ADN, il est couramment utilisé comme colorant en biologie moléculaire. Ce colorant exposé aux rayons ultraviolets donnera une fluorescence avec une couleur rouge-orange. EtBr doit être ajouté à une concentration finale de 0,5 μg/ml dans le gel avant que celui-ci soit versé dans le moule. Alternativement, le gel d’agarose peut être coloré après électrophorèse dans une solution de bromure d’éthidium 0,5 μg/ml.

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4- Équipement et matériel

  • Hotte laminaire pour PCR
  • Anse pour ensemencement
  • Bouteilles en verre 100 ml Corning
  • Incubateur à 37oC+/-1oC
  • Micropipettes
  • Pointes universelles avec filtre DNase/RNase free
  • Microtubes 1,5 ml
  • Tubes pour PCR 0,2 ou 0,5 ml
  • Thermocycleur
  • H2O déionisée Milli-Q
  • Appareil pour électrophorèse
  • Transilluminateur pour ultraviolets
  • Micro-onde

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5- Réactifs et milieux

  • Gélose sang et gélose MacConkey
  • Bouillon Luria-Bertani
  • Tampon FA ou PBS
  • Mélange pour la réaction PCR (Annexe 2)
    • dNTP mélange dNTP en solution mère (GE Healthcare)
    • 10X PCR tampon (BIOTOOLS ou l’équivalent)
    • MgCl2 solution mère 50 mM (BIOTOOLS ou l’équivalent)
    • Taq DNA polymérase (BIOTOOLS ou l’équivalent)
  • Oligonucléotides synthétisés (amorces)
  • Tampon pour électrophorèse
  • Marqueur de masse moléculaire (In Vitrogen)
  • Agarose
  • Colorant
  • Solution d’EtBr

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6- Dispositifs de sécurité et de protection

Certaines souches STEC/VTEC peuvent infecter l’homme à une dose infectieuse très faible et peuvent provoquer des maladies graves. Des infections contractées en laboratoire ont déjà été signalées. Par conséquent, travailler avec des souches STEC/VTEC requiert de bonnes pratiques de laboratoires et l’utilisation de dispositifs de sécurité. EtBr est un agent mutagène et toxique. Lors de sa manipulation, il doit donc être utilisé en conformité avec la fiche de sécurité fournie et avec le matériel de protection recommandé ( gants en nitrile, sarrau et contenant bien identifié). La lumière U.V (ultraviolets) peut causer des dommages aux yeux; l’utilisation d’écran en plexiglass et de lunettes de protection est donc obligatoire.

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7- Souches de référence

Les souches de référence peuvent être préparées à l’avance et conservées à −20oC en aliquots de 50 μl pour une période de 8 mois. Les fiches signalétiques pour les souches de référence se trouvent à l’ Annexe 4.

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8- Interprétation des résultats

Les échantillons présentant des fragments d’amplification de la taille désirée (Annexe 1) sont considérés comme positifs pour les gènes ciblés. Les contrôles positifs et négatifs doivent être inclus dans chaque réaction et donner des résultats positifs et négatifs, respectivement.

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